2.2.6细胞形态

　　24 h后，在硼硅玻璃盖上培养的细胞在PBS 1X中冲洗3次，并在4%的PFA中室温固定10分钟。在PBS 1X中冲洗3次，在0.1%v/v Triton-X100 (ThermoFisher，美国)的PBS 1X中室温渗透15分钟。通过在室温下将细胞浸泡在3%w/v的牛血清白蛋白(BSA, Sigma Aldrich，美国)PBS 1X中1小时，使特异性抗原位点饱和。肌动蛋白细胞骨架染色方法是在室温黑暗环境下，在Dylight 488 (ThermoFisher Scientific，美国)偶联Phalloidin中孵育1小时。ɑ-tubulin的免疫标记首先通过与单克隆小鼠抗ɑ-tubulin抗体(SantaCruz Biotechnology，美国)在室温下杂交1小时进行，然后与与Dylight 550偶联的山羊抗小鼠抗体(ThermoFisher Scientific)在室温下杂交1小时进行。如上所述，用Hoechst 33,342染色核。

　　2.2.7培养上清液中钙的荧光剂量

　　在粉末提取物中细胞培养24小时后，收集培养上清液，并根据制造商在黑色96孔板(康宁，美国)中的说明，使用商业荧光剂量法(Abcam，英国)测定钙的剂量。荧光在平板阅读器(flustar Optima, BMG Labtech，德国)中测量，激发为544 nm，发射为590 nm。

　　2.2.8显微图像分析和统计学分析

　　对于每个需要进行显微镜观察的实验，使用垂直AxioImager M2荧光显微镜与AxioCam MRm相机(Zeiss，德国)耦合成像至少10个场。然后使用ImageJ软件对图像进行分析。通过计数Hoechst 33,342个阳性核来测量细胞密度，反映细胞数量，并报告为细胞数/cm2。增殖率计算为EdU阳性核占Hoechst 33,432个阳性核的百分比。

　　对于每个测试，至少进行了3个独立的实验，使用新鲜制备的粉末提取物。使用GraphPad Prism 9进行统计分析。采用Shapiro-Wilk检验检验数据是否正常。根据数据集和正态检验结果，进行Kruskal-Wallis检验，然后进行Dunn 's事后检验(非参数)，或者进行ANOVA单向检验，然后进行Tukey事后检验。p≤0.05为差异显著。

　　2.2.6细胞形态

　　24 h后，在硼硅玻璃盖上培养的细胞在PBS 1X中冲洗3次，并在4%的PFA中室温固定10分钟。在PBS 1X中冲洗3次，在0.1%v/v Triton-X100 (ThermoFisher，美国)的PBS 1X中室温渗透15分钟。通过在室温下将细胞浸泡在3%w/v的牛血清白蛋白(BSA, Sigma Aldrich，美国)PBS 1X中1小时，使特异性抗原位点饱和。肌动蛋白细胞骨架染色方法是在室温黑暗环境下，在Dylight 488 (ThermoFisher Scientific，美国)偶联Phalloidin中孵育1小时。ɑ-tubulin的免疫标记首先通过与单克隆小鼠抗ɑ-tubulin抗体(SantaCruz Biotechnology，美国)在室温下杂交1小时进行，然后与与Dylight 550偶联的山羊抗小鼠抗体(ThermoFisher Scientific)在室温下杂交1小时进行。如上所述，用Hoechst 33,342染色核。

　　2.2.7培养上清液中钙的荧光剂量

　　在粉末提取物中细胞培养24小时后，收集培养上清液，并根据制造商在黑色96孔板(康宁，美国)中的说明，使用商业荧光剂量法(Abcam，英国)测定钙的剂量。荧光在平板阅读器(flustar Optima, BMG Labtech，德国)中测量，激发为544 nm，发射为590 nm。

　　2.2.8显微图像分析和统计学分析

　　对于每个需要进行显微镜观察的实验，使用垂直AxioImager M2荧光显微镜与AxioCam MRm相机(Zeiss，德国)耦合成像至少10个场。然后使用ImageJ软件对图像进行分析。通过计数Hoechst 33,342个阳性核来测量细胞密度，反映细胞数量，并报告为细胞数/cm2。增殖率计算为EdU阳性核占Hoechst 33,432个阳性核的百分比。

　　3结果与讨论

　　3.1生蚝壳粉的表征

　　SEM分析提供了OSP颗粒的显微照片。图1A在高倍放大下显示了具有典型外棱柱状壳层或片状壳层的粒子表面的细节。它们一般以牡蛎壳的生长方向为导向(Yoon et al.， 2003)。表面不规则，有大量碎屑，如短矿物纤维，如图1B所示。显示了所选粉末颗粒的整体形貌和尺寸。

　　对于每个测试，至少进行了3个独立的实验，使用新鲜制备的粉末提取物。使用GraphPad Prism 9进行统计分析。采用Shapiro-Wilk检验检验数据是否正常。根据数据集和正态检验结果，进行Kruskal-Wallis检验，然后进行Dunn 's事后检验(非参数)，或者进行ANOVA单向检验，然后进行Tukey事后检验。p≤0.05为差异显著。

　　对OSP样品进行了能量色散X射线分析(EDS)。钙(36.09%)、氧(47.25%)、碳(14.43%)的存在*为明显。镁(0.71%)、钠(1.53%)、硅(1.53%)等元素也微量存在。这些元素可以取代碳酸盐中的钙。

　　图2A。显示原始OSP的X线图。方解石是粉末的主要矿物成分(JCPDS N°47-1743)。没有文石相，其他多态生物碳酸盐被检测到。原始样品中锐利的衍射峰的存在表明高结晶度(菱形显微结构- r 3¯m空间群)。

　　FT-IR特征波段为1403.92 cm−1,873.59 cm−1,711.60 cm−1(图2B)。1403.92 cm−1和873.59 cm−1分别对应ν3-不对称CO3拉伸和ν1不对称CO3变形。711.73 cm−1归因于ν4对称CO3形变。873.59 cm−1和711.60 cm-1带与方解石参考振动带密切匹配(Gunasekaran等人，2006;Rujitanapanich et al.， 2014)，并确认了方解石中生蚝壳粉的组成。轻微的变化可能归因于杂质和/或碳酸盐基团的变形。

　　图2C显示了对原始OSP进行TGA/DTA的结果。样品中存在的有机物和湿度在150°C到200°C之间被去除。DTA曲线所示的吸热反应记录在700°C到820°C之间。通过CaCO3→CaO+CO2的反应，观察到CaCO3的煅烧分解为CaO↑(Choi et al.， 2011;哈桑·马哈茂德等人，2015;Cudrado and Rica, 2017)。这一测量证实了牡蛎壳粉的化学成分。